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生物反應器有哪些應用

發布日期:2019/04/11

  1.改良乳汁品質;

  2.生產藥用蛋白。

  3.外源基因在動物體內的位點整合問題;

  4.乳蛋白基因表達組織特異性問題;

  5.目的蛋白的翻譯後修飾問題;

  6.轉基因表達產物的分離和純化問題;

  7.轉基因的技術與方法問題;

  8.倫理道德問題。

  膀胱生物反應器

  膀胱反應器有著和乳腺反應器一樣的優點:收集產物蛋白比較容易,不必對動物造成傷害。此外,該係統可從動物一出生就收集產物,不論動物的性別和是否正處於生殖期。膀胱生物反應器 *顯著的優勢在於從尿中提取蛋白質比在乳汁中提取簡便、高效。

  膀胱生物反應器多用Uroplakin啟動子啟動人生長激素(hGH)的表達,產生 hGH特異性的高豐度RNA,這些RNA與蛋白分泌量高度相關。Uroplakin基因在多種哺乳動物體內有很高的保守性,如鼠、兔、牛、羊和人等。

  生長激素 Kerr等[12]將pUPII-LacI用質粒的Kpn i進行消化,用T4DNA多聚酶切去3'端,然後用BamHI消化,分離出3.6kb的5'端小鼠UPII基因片段,此片段含有膀胱反應器特異性表達所需的大部分序列。將此片段與位於無啟動子的pOGH質粒純化SaI和BamHI位點間的hGH結構基因的5'端連接,得到pUPII-hGH質粒,能表達該質粒的組織分布有限。將得到的pUPII- hGH質粒用HindIII和EcoRI消化,得出一段5.7kb的UPII-hGH融合基因可用於顯微注射,在膀胱上皮細胞中合成hGH,收集轉基因動物尿液,從中提取重組蛋白。但在這一途徑中轉基因動物會因hGH的作用逐漸肥胖,並導致雌性動物不育症。乳腺生物反應器也能表達hGH。用同源重組方法將hGH基因導入210kb的人α-乳球蛋白位置依賴性YAC載體,將重組的YAC dNA顯微注入大鼠胚胎,轉基因大鼠的乳汁中含有高水平的hGH,含量可達0.25~8.9mg/ml[13]。

  翻譯與修飾

  轉基因動物分泌的蛋白,特別是糖鏈成分的結構與人體蛋白有差異。因此研究分泌蛋白的修飾就顯得很重要。在乳腺生物反應器中,蛋白質翻譯前修飾的主要方式是在多個位點對乳腺中的蛋白前體進行信號肽剪切和對糖鏈進行修飾。例如,從山羊乳液中得到的長效組織型纖溶酶原激活劑與人體內和相比較,含有少量的異種(外源)低聚糖,同時,唾液酸、N-乙酰葡萄糖胺和半乳糖含量明顯減少,關且出現缺少蛋白質C127的N-乙酰半乳糖胺。此外,從豬乳液中得到的C蛋白中是沒有的;從羊乳液中得到的重組α1-抗胰蛋白酶多聚肽也反映了唾液酸酸化程度的差異;在山羊乳腺中觀察到了重組抗凝血酶Ⅲ上低聚甘露糖與特異天冬酰胺的位點特異性聚合等等。研究小鼠乳液中的重組γ-幹擾素可對翻譯前修飾有更好的理解,γ-幹擾素有大量的位點特異性變化,在N端連接位點進行複雜的唾液酸酸化和連接核心岩藻多聚糖,其次是低聚甘露糖。與從小鼠細胞中取得的蛋白質相比,分泌的重組蛋白沒有GalNAc、NeuGC和Gal∞l 、3Gal-βl、 4GlcNAc殘基。這些蛋白特異性的糖基化類型可與細胞上的受體結合並清除病人體內的重組蛋白,因此可能會影響療效, *終的結果尚有待驗證。

  同源組織表達蛋白質的優點是可對表達產物進行調控並校正珠蛋白鏈的翻譯過程,避免無效的翻譯前修飾,使產物蛋白盡可能與人體天然蛋白相似,降低人體內的排斥反應,提高藥物蛋白療效。目前,蛋白分離技術飛速發展,大大提高了蛋白質分離的可行性和分離效率。第二種技術路線中目前以乳腺生物反應器較為多見,因為乳汁易得到,且乳汁中的特異蛋白含量較大,對蛋白水解酶的降解作用也比較穩定。乳汁是一種混合物,含3%~6%的總蛋白,3%~5%的脂類,對蛋白提純技術要求比較高。另一方麵,藥用蛋白是在動物乳腺中產生。因此隻有含轉基因型人雌性動物在泌乳期才能生產藥用蛋白,可用的動物數目有限,且生產期較短。膀胱生物反應器的優點在於含有轉基因型的兩性動物都可用,產後收集時間長,提取產物蛋白濃度雙乳液中的含量低得多,盡管收集的尿液多且時間長,生產單位數量的藥用蛋白在乳腺和膀胱生物反應器中的成本是差不多的

  問題與展望

  在轉基因動物生物反應器的應用中,有些問題尚待解決。比如,由於轉基因動物的基因是鑲嵌整合型的,因此它的下一代並不都轉基因型。但是在綿羊,豬和山羊中觀察到隻要轉基因型從起始個體傳給了下一代,這種轉基因型就可以穩定地遺傳好幾代。而其他一些因素,如外源基因的整合率低,胚胎移植的受孕率低等都使有效的轉基因動物大大減少。同時,由於對調控表達水平的程序,指導進行 的組織特異性和發育調控表達的程序,以及調控和編碼內含子序列間可能的相互作用的認識尚不充分[14],容易引起異位點表達;由於現在的技術還不能控製整合的位點,因此存在對內源基因進行插入誘變的可能性,轉基因型的表達會受整合的不同位點的影響。這些因素使得在家畜長成前,要用小鼠對新基因構型進行常規試驗。

  轉基因動物生產的藥用蛋白可用於預防和治療疾病,其轉運係統及口服用藥引起的耐受性等問題都在作進一步研究。以轉基因家畜生產珍貴的藥用蛋白具有重大的經濟價值和社會效益,這項生物技術 *終將會得到廣泛應用。